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最新进展

研究工作进展:
    2007-2008 年度  开展了许多原创性工作,在多个领域中都取得了可喜的成就,尤其在哺乳动物受精机理、表观遗传学、动物体细胞克隆、转基因动物、干细胞研究等方面进展显著。
    1  、哺乳动物生殖生物学与生殖技术
    负责人:旭日干  院士
    主要研究人员:邵华、王志刚、关泽红、郭旭东、夏雅娟、邢万金、芒烈、段彪、刘东军、于海泉、仓明
    I  、胚胎干细胞研究
    (1) 建立包含有未生长卵子和成熟卵子基因组的二倍体小鼠孤雌胚胎干细胞系
    我们发明了一套基于“ Zona-free  ”的生发泡移植技术程序。将 GV 期卵子的透明带去除,然后进行去核。去核 GV 期卵子经 PHA-P  与未生长卵子进行粘合,再经电脉冲刺激形成融合重构卵。本研究使用 383 枚 GV 期卵子共获得 64 枚来自未生长卵子的 MII  期卵子,再与体内成熟卵进行核移植形成新的重构卵。经激活处理后,获得 13 枚囊胚。从这 13 枚囊胚共分离得到 3 株孤雌胚胎干细胞系 (NF-pES)  。利用这些细胞系进行嵌合体实验,结果表明在心脏,脾脏,肾脏和骨髓等器官中都有嵌合存在。利用 NF-pES 细胞成功建立了肌肉损伤修复小鼠模型。该成果发表于“  Cell Biology International ”, 2007, 31(11):1336-1344 。
    (2)  杂合孤雌胚胎干细胞系的建立
    将小鼠第二次减数分裂中期 (MII)  卵子的纺锤体移植到另一枚卵子中,孤雌激活后排出两个极体,体外发育得到囊胚。将得到的囊胚种植到经丝裂霉素处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上。分离得到 3  株孤雌胚胎干细胞系,经检测属于胚胎干细胞。经嵌合体实验得到了可以进入生殖系的嵌合体小鼠。
    II  、环境激素的生殖毒理研究
    三氧化二砷是环境毒素之一,对机体的健康损害是全身性、多系统的,也是已被肯定的人类致癌源。在对 Hela  细胞培养时发现,当培养基中分别添加雌二醇、三氧化二砷、雌二醇拮抗剂 (500nM) ,三氧化二砷具有雌激素样效应, 1.0μM 是对 Hela  细胞生长影响的分界点。
    采用宫颈黏液结晶法对不同浓度慢性砷暴露小鼠动情周期进行检查,结果显示不同浓度的三氧化二砷均使小鼠动情周期发生紊乱。动情周期的紊乱是反应性激素代谢失调的敏感指标,因此本研究初步证明砷具有影响机体内分泌的作用,当属环境内分泌干扰物。
    采用等离子质谱方法检测了慢性砷暴露雌鼠血砷的变化,并通过  RT-PCR 的方法检测了慢性砷暴露雌鼠生殖器官子宫、卵巢 ERα 及 PRmRNA 的表达情况。随着血砷浓度增加, ERαmRNA  表达总体呈下降趋势;砷暴露各组子宫和卵巢的 ERαmRNA 表达显著降低,并与对照组之间差异显著 (P<0.05) ;砷暴露小鼠子宫的 PRmRNA  表达总体也呈下降趋势 ; 砷暴露各组小鼠睾丸 ERαmRNA 表达水平高于对照组,且随着血砷浓度增加 ERαmRNA 表达增加,但在高浓度时 ERαmRNA  表达又有所下降,但总体变化差异不显著 (P>0.05) ;砷暴露各组睾丸 PRmRNA 与对照组比较表达增强,但总体变化同样差异不显著  (P>0.05) ;孕鼠子宫 ERαmRNA 表达随砷暴露浓度增高而增高, PRmRNA 表达随砷暴露浓度增高反而降低;孕鼠卵巢随着血砷浓度升高,  ERαmRNA 表达降低, PRmRNA 表达增强;小鼠胚胎 ERαmRNA 表达随着血砷浓度升高而增强,与对照组比较,差异显著 (P<0.05) ,  PRmRNA 的表达水平也高于对照组,但无显著差异 (P>0.05) 。

III 、精卵质膜融合机理研究
    绒山羊和绵羊 Izumo1 和 CD9 基因的克隆及其相互作用的初步研究
    在精卵融合分子中,精子上的免疫球蛋白超家族 ( IgSF ) 新成员 Izumo1 和卵子上的四次跨膜蛋白超家族 ( TM4SF ) 成员 CD9 证明是精卵融合必需的分子。本研究克隆了绵羊和绒山羊的 Izumo1 基因组 DNA 和 cDNA 以及 CD9 的 cDNA ,绵羊 Izumo1 基因长 4600 bp ,绒山羊 Izumo1 基因长 4598 bp ,二者同源性高达 99.9% ,并与牛、鼠和人 Izumo1 基因高度同源。将绵羊和绒山羊的 Izumo1 DNA 和 cDNA 序列对比分析后发现羊 Izumo1 有多种选择性剪接形式,其中完整的开放阅读框 ( ORF ) 长 963 bp ,由 8 个外显子剪接而成,编码 320 个氨基酸的肽链。该肽链在 C 端有 1 个跨膜结构域,胞外有免疫球蛋白样结构域。绒山羊 Izumo1cDNA 具有 del 69 、 del 182 和 del 217 三种选择性剪接异构体;绵羊 Izumo1cDNA 具有 del 69 和 ins 30 两种选择性剪接异构体。所有这 4 种选择性剪接均是典型的 GT-AG 内含子剪接,但由于肽链中间缺失或者 C 端截短,它们都部分或全部失去了免疫球蛋白样结构域。对羊 Izumo1 的氨基酸序列进行生物信息学分析显示其在结构上与小鼠 Izumo1 相似, N 端有一个氨基酸 1-22 组成的信号肽、 C 末端有一个氨基酸 302-319 组成的跨膜区,中间有一个氨基酸 161-252 组成的免疫球蛋白结构域,并在其上有一个潜在的 N- 糖基化位点 ( N 205 ) 。绵羊和绒山羊 CD9 cDNA 克隆均得到 1123 bp 序列,包含一个 681 bp 的完整开放阅读框,编码 226 个氨基酸的肽链。该肽链具有典型的 4 次跨膜蛋白家族特征。一个 N- 糖基化位点 (N 50 ) 、 4 个跨膜区、两个胞外环和一个被公认为 4 次跨膜蛋白家族标志的 CCG 基序。绵羊和绒山羊 CD9 氨基酸序列有 99.1% 相同,并与牛、鼠和人的 CD9 高度同源。
    通过大肠杆菌表达绵羊 CD9 和绒山羊 Izumo1 重组蛋白,并成功地制作了小鼠抗羊 Izumo1 腹水多克隆抗体。用自制的抗体进行免疫组化研究显示绒山羊的 Izumo1 蛋白存在于睾丸精子发生过程中减数分裂各期细胞中,定位于单倍体圆形精细胞的细胞核内,随着精细胞变形,在长形精子中形成窄条状分布,最终转位至成熟精子头部的赤道环上。 RNA 原位杂交结果显示绒山羊 Izumo1 基因在初级精母细胞中转录。 该成果发表于“ Reproduction in Domestic Animals ” , 2009 。
    IV 、动物转基因研究
    (1) 转胰岛素样生长因子 I 基因绒山羊研究
    以毛囊特异表达的启动子 pKAP6-1 、 pUHS 分别引导胰岛素样生长因子 (IGF1) 基因,以新霉素抗性基因和红色荧光蛋白基因作为双选择标记,构建成功 2 个毛囊细胞中特异性表达 IGF1 的表达载体。通过 PCR 和 RT-PCR 方法从绵羊总 DNA 和总 RNA 中分别扩增出角蛋白关联蛋白 6-1 基因 (KAP6-1) 启动子区序列和绵羊胰岛素样生长因子 (IGF1) 编码区 cDNA 序列,以 pMD19T 为克隆骨架构建成中间克隆载体 p19TKI 。将 CMV 启动子序列连接在 pDsRed2-1 表达框架的红色荧光蛋白报告基因 (Red2) 上游 KpnI+ SmaI 位点构成 pCDsRed2 ; pCDsRed2 经 EcoRI 酶切,与 p19TKI 的 KI 片段连接构成 IGF1 毛囊细胞特异表达的第一种载体 pCDsR-KI 。
    以 PCR 方法从小鼠基因组 DNA 扩增出超高硫角蛋白基因 (UHS) 启动子区序列,与 pMD19T 、 IGF1 cDNA(SalI + SphI 酶切片段 ) 构建成中间克隆载体 p19TUI ; pCDsRed2 经 SacI+ EcoRI 酶切、 Klenow Fragment 补平 EcoRI 端,与 p19TUI 的 UI 片段 ( 经过 SacI+ SphI 酶切、 Klenow Fragment 补平 SphI 端 ) 连接构成毛囊细胞特异表达的第二种载体 pCDsR-UI 。
    利用体外转染技术将此 2 个表达载体分别导入绒山羊胎儿成纤维细胞,通过 G418 筛选出稳定表达红色荧光蛋白的 2 种克隆细胞;以体细胞核移植技术制备绒山羊转基因克隆胚胎。在所得到的 31 枚囊胚中,表达红色荧光蛋白的囊胚数 17 枚,阳性率为 55% 。 该成果发表于“中国科 学”, 2008, 38(12): 1152-1159 。

(2) 利用 RNAi 抑制小鼠胎儿成纤维细胞中 FGF5 基因的表达
    运用 RNA 干扰技术对 eGFP 转基因小鼠胎儿成纤维细胞中的 FGF5 基因进行了干扰。首先针对小鼠 FGF5 mRNA 的第 316-335bp 区域、第 499-518bp 区域和第 766-785bp 区域分别设计了发夹式 RNA 干扰片段,经合成和退火后,连接到 pSilencer 3.0-H1 载体上,再把 H1 和干扰片段一同酶切下来,并将带有 H1 启动子的干扰片段连接到红色荧光表达载体 pCDsR 上,分别命名为 pCDsR- shRNA316(VI) 、 pCDsR-shRNA499(VII) 、 pCDsR-shRNA766(VIII) 。用 SYBR GREENI 荧光定量 PCR 方法对转染了不同干扰载体的细胞 cDNA 进行检测。结果表明,小鼠 FGF5 mRNA 的第 766-785bp 区域不是有效干扰区域;第 316-335bp 区域和第 499-518bp 区域是有效干扰区域,其中第 499-518bp 区域是最合适的干扰区域。
    V 、 mTOR 信号通路在细胞生长调控中的作用与机制
     mTOR 是一种存在于哺乳动物细胞中的 Ser/Thr 激酶,可以汇聚和整合来自于营养、生长因子、能量和环境胁迫对细胞的刺激信号,进而调节细胞生长。 TOR 基因和 TSC2 基因在肿瘤细胞 SEG-1 中高表达;使用 mTOR 特异性抑制剂 RAD001 处理 SEG-1 细胞,结果显示 SEG-1 细胞对 RAD001 敏感; mTOR 抑制可引起 SEG-1 细胞周期阻滞,细胞形态发生改变,抑制细胞增殖甚至导致细胞死亡; mTOR 被抑制可强烈抑制其下游靶 S6 的磷酸化,同时还抑制 mTOR 、 S6K1 和 S6 基因的表达,且这些抑制效应都具有剂量依赖关系; TAE226 对 FAK 和 IGF-IR 的抑制导致了 mTOR 信号通路活性的强烈抑制,预示 FAK 可能是 mTOR 信号通路的调节因子。
    本研究克隆了内蒙古白绒山羊 mTOR 基因约 8.6Kb 的全长 cDNA 及 S6K1 、 S6K2 、 S6 和 FAK 基因的部分 cDNA 片段,序列分析表明几个基因在进化上都是高度保守的。表达模式分析表明 mTOR 基因、 S6K1 基因和 S6K2 基因在脾、肾、睾丸和肌肉中都有表达,在肾中表达稍强,脾中稍弱; S6 基因在脾、睾丸和肌肉中都高表达; FAK 基因在脾、睾丸和肌肉中都有表达,在睾丸中稍弱一些。使用 mTOR 特异性抑制剂 CCI-779 处理内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞 (GFb) 。 GFb 对 CCI-779 敏感, CCI-779 对 GFb 具有细胞毒性。 CCI-779 处理可导致细胞生长抑制,在 24 小时内引起细胞死亡。 mTOR 抑制可引起 GFb 细胞周期阻滞,细胞骨架失去正常组织结构,形态发生明显改变。 CCI-779 微弱抑制 mTOR 的磷酸化,强烈抑制 S6 的磷酸化,同时还抑制 mTOR 、 Akt 、 S6K1 和 S6 基因的表达,并可引起 35KD Caspase-3 酶原量减少,且这些抑制均具有剂量依赖效应。 CCI-779 抑制 mTOR 信号通路的活性,抑制细胞增殖。 mTOR 被抑制不仅影响其下游 S6 的磷酸化,而且抑制 Akt 、 S6K1 和 S6 基因的表达,并可能具有诱导绒山羊胎儿成纤维细胞凋亡的作用。目前,已分别将山羊 mTOR 基因 cDNA 编码区 3' 端核苷酸序列、 S6K1 基因 cDNA 编码区核苷酸序列、 S6K2 基因 cDNA 编码区核苷酸序列、 FAK 基因 cDNA 编码区核苷酸序列申报国家专利。
    VI 、 CDK2 在 HSV 复制及细胞增殖中的调控
    疱疹病毒宿主广泛,引起人和许多动物多种多样的感染。疱疹病毒复制机理的研究对发展病毒与宿主细胞相互作用的理论、抗病毒药物的开发以减轻疱疹病毒对人类健康的威胁、减少牛业的巨大经济损失有重要意义。目前对于 HSV 等病毒复制所需 CDK 种类还不清楚。我们假设 CDK2 可能是 HSV 复制和重新激活的关键性启动因素。本研究以表达显性负突变体 CDK2(dn-CDK2) 的 HT29Tet-On dn-CDK2 细胞系、靶向 CyclinA 、 CyclinE 及 CDK2 的干扰 RNA 等多种措施抑制 CDK2 活性,研究 CDK2 在 HSV 复制中的作用。结果表明, HSV 在 CDK2 活性下降的 HT29Tet-On dn-CDK2 细胞中的增殖具有感染剂量依赖性; HSV 感染宿主细胞 6 小时后 CDK2 活性被诱导; HSV 增殖动力学分析表明在宿主细胞 CDK2 活性被诱导后, HSV 即进入了快速增殖阶段。这一发现首次直接证明了 CDK2 活性与 HSV 复制的关系。用微球菌核酸酶 (MCN) 消化进行的尝试性实验发现: HSV 感染 CDK2 下降细胞 5 小时后其基因组 DNA 仍以结构紧密的染色体形式存在, HSV 基因组的存在形式与宿主细胞 CDK2 活性有关。这一发现为进一步研究 CDK2 调控 HSV 基因转录的机制提供了线索。
 2、体外受精和克隆技术影响胚胎发育和基因表达的机理研究
    负责人:于海泉
    主要研究人员:吴侠、李燕、岳永莉、辛鹏慧、王玲玲、李轲涵、奥旭东、白海栋
    本课题从胚胎基因组整体范围以及发育相关基因的单基因位点系统研究了表观遗传修饰对体外受精和体细胞克隆胚胎发育的影响。 ① 首先对体外受精胚胎和体细胞克隆胚胎整体范围内基因组表观遗传修饰特性进行检测; ② 选择早期胚胎发育阶段中特异表达的基因,研究体外受精、核移植操作对重编程中早期胚胎单个基因座位上 DNA 甲基化和组蛋白修饰的改变,及其对于早期胚胎发育的影响,探讨体外受精和体细胞克隆体系对早期胚胎发育的影响。 ③ 通过药物处理改变体外胚胎的表观遗传特性,探讨提高体外受精和核移植技术效率的方法; ④ 利用实时定量 PCR 和免疫组织化学方法检测了组蛋白 3 特异性转移酶 SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3) 基因 mRNA 和蛋白质的动态变化,并利用 RNAi 技术研究了 SMYD3 基因在牛卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育中的作用。研究结果表明, ① 体外受精和核移植操作造成基因组整体范围不同的表观遗传修饰变化; ② 利用 TSA 处理后的卵母细胞胞质明显促进了供体核的表观遗传重编程, TSA 处理后的卵母细胞能促进孤雌胚胎和克隆胚胎的囊胚率, TSA 处理明显增加转基因体细胞的报告基因的表达,并能增加了表达外源基因囊胚的比率; ③ 核移植过程同样存在着单基因位点的重编程异常,单基因位点的 DNA 甲基化以及组蛋白修饰影响着基因的表达调控,并在不同来源的胚胎细胞中其表观遗传修饰特性不同; ④ SMYD3 可能通过激活胚胎从 2 细胞到囊胚发育中起关键作用的基因来调节发育,并且这种影响是在卵母细胞成熟晚期而非受精后建立的。
    (1) 体外受精和核移植技术影响胚胎基因组整体范围的表观遗传特性
    1) 牛卵母细胞体外成熟及体外受精胚胎早期发育过程中组蛋白修饰存在动态变化
    本研究探讨了组蛋白 H3 、 H4 不同甲基化 (H3K9me2 , H3K4me3) 、乙酰化修饰位点 (H3K 9ac , H3K 18ac 和 H4K 8ac 、 H4K5ac) 在牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。卵母细胞成熟有其特异的组蛋白修饰动态转变,组蛋白乙酰化逐渐被去除;受精是组蛋白甲基化、乙酰化逐渐恢复的过程,且不同修饰位点有其自身的动态变化特点;在胚胎发育过程中维持了组蛋白乙酰化、甲基化修饰。在受精及胚胎发育过程中,相同组蛋白的不同位点有相似的变化模式 (H3K 9ac vs H3K 18ac ; H4K 8ac vs H4K5ac) ;功能相关的不同组蛋白修饰有其类似的动态变化 (H3K 9ac 、 H3K 18ac vs H3K4me3) ,并且组蛋白乙酰化在牛胚胎细胞核中的定位也可能与合子基因组激活有关 (H4K 8ac 、 H4K5ac) ;而且组蛋白修饰与 DNA 甲基化密切相关 (H3K9me2) 。
    2) 牛体外受精胚胎与体细胞克隆胚胎发育过程中组蛋白修饰存在差异
    间接免疫荧光技术显示,从原核期到 8- 细胞期,克隆胚胎与体外受精胚胎存在着明显的组蛋白乙酰化、甲基化修饰的差异。高水平的 H3K 9ac 、 H3K 18ac 、 H4K 5ac 、 H4K 8ac 、 H3K4me3 和 H3K9me2 存在于 8- 细胞期之前的各期克隆胚胎中,并且 H4K 5ac 和 H4K 8ac 在克隆胚胎细胞核中的定位与体外受精胚胎也存在明显差异。 8- 细胞期以后,除了 H3K9me2 ,其他组蛋白乙酰化、甲基化修饰的荧光强度及定位,在克隆胚胎都与体外受精胚胎类似。因此,克隆胚 8- 细胞前的发育阶段,存在着明显的组蛋白修饰异常,但当供体核基因组被激活,供体核组蛋白修饰经历较大程度的重编程,使得克隆胚胎与体外受精胚胎具有类似的组蛋白修饰模式。
    3) 异种重构胚 1- 细胞期组蛋白乙酰化重编程的研究
    利用荧光免疫化学方法检测了绒山羊 - 牛异种核移植胚胎 1- 细胞期组蛋白 H3K9 、 H3K18 和 H4K8 乙酰化的动态变化,并与牛同种核移植胚胎在 1- 细胞期组蛋白乙酰化的动态变化进行了比较。结果显示,两种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式,即供体核发生早期染色体凝集,组蛋白 H3K9 、 H3K18 去乙酰化;重构胚被激活,组蛋白 H3K9 、 H3K18 重新被乙酰化。而组蛋白 H4K8 却表现出不同的变化模式,即早期染色体凝集时仅发生部分的去乙酰化。同种与异种重构胚具有一致的组蛋白乙酰化修饰模式,说明牛卵母细胞对不同种属体细胞组蛋白乙酰化的重编程并没有差异。
 (2) 表观遗传特性的改变对于胚胎发育的影响
    1) TSA 处理卵母细胞影响克隆胚胎发育及表观遗传重编程
    本试验使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂 (TSA) 处理卵母细胞,探讨其对卵母细胞组蛋白乙酰化、克隆胚胎发育及供体细胞染色质重编程的影响。结果表明卵母细胞成熟率与 TSA 浓度呈明显的剂量相关,药物处理后明显增加了卵母细胞组蛋白乙酰化水平。 TSA 处理后的卵母细胞既促进了孤雌胚胎的发育,也促进了克隆胚胎的发育,但是处理组与对照组囊胚细胞数没有明显差异。当供体细胞核发生早期染色体凝集时,对照和处理组 H3K 9ac 、 H3K 18ac 荧光信号消失;对照组供体染色体 H4K 8ac 明显减弱,处理组该位点乙酰化消失;体细胞核 H4K 5ac 信号在对照组卵母细胞中没有明显变化,处理组 H4K 5ac 信号明显减弱。当重构胚被激活时,所用组蛋白乙酰化信号迅速恢复。 TSA 处理的卵母细胞还明显增加了供体染色质的稳定性 (74.2% vs 39.6% , P<0.01) 。
    2) TSA 处理对异种重构胚发育的影响
    使用 1ng/ml TSA 分别处理绒山羊 - 牛异种重构胚 4hr 和 24hr ,各处理组 (4hr 、 24hr) 与对照组之间在卵裂率及 8- 细胞率上均无显著差异 (P>0.05) ,但使用 TSA 处理异种重构胚 24hr 后显著地降低了桑囊率 (4.79% vs 13.68% , P<0.05) ,说明较长时间的 TSA 处理将影响绒山羊 - 牛核移植重构胚的正常发育。该成果发表于 “Animal Biotechnology” , 2008, 19: 211-224 。
    (3) 发育相关基因克隆、测序及单基因位点表达的表观遗传调控
    1) 表观遗传调节机制 DNA 甲基化修饰调控牛体细胞中 Gadd 45a 基因的表达
    生长阻滞和 DNA 损伤基因 (growth arrest and DNA damage, gadd) 家族与细胞生长抑制和凋亡有关,该家族成员 Gadd 45a 在维持基因组稳定性中发挥重要作用。选定该基因调控区中的 7 个 CpG 位点,利用甲基化特异性 PCR 检测其 DNA 甲基化状态。 Gadd 45a 在心脏中的甲基化程度明显高于其他三种组织。利用染色质免疫共沉淀技术对成年牛组织中 Gadd 45a 基因 3′ 调控区的 H3 乙酰化、 H3K9 甲基化状态进行了检测。 H3 乙酰化程度在心脏、肾脏中高于在肝脏和睾丸中的水平。 H3K9 甲基化程度在心脏、肾脏中也明显高于其它两种组织。表明 Gadd 45a 基因调控区 H3K9 甲基化对 Gadd 45a 的表达具有一定的抑制作用,而该调控区 H3 乙酰化对组织特异性表达影响较小。
    2) 牛体细胞中端粒酶逆转录酶组分的的表达受 DNA 甲基化调节并控制端粒酶活性
    通过对成年牛组织中端粒酶的这两种组分的表达情况及端粒酶活性状态进行检测,探讨牛端粒酶组分的组织特异性表达以及与端粒酶活性之间的关系。应用 RT-PCR 检测了成年牛的心脏、肾脏、肝脏及睾丸中 TERC 和 TERT 基因的 mRNA 表达情况,利用 TRAP 银染法检测各组织中的端粒酶活性状态。结果表明 TERC 基因在这 4 种组织中均有表达,但转录水平在各组织之间有差异; TERT 基因仅在睾丸中表达,在其他 3 种组织中均没有表达,端粒酶活性同样只在睾丸中检测到。由此可见牛端粒酶活性在体细胞中普遍受到抑制,仅在生殖腺中具有活性。端粒酶两种组分的转录是相互独立的,逆转录酶 TERT 组分是端粒酶活性的关键成分。
    3) DNA 甲基化和组蛋白修饰对牛 ZAR1 基因表达调控的研究
    合子阻滞因子 1(Zygote arrest 1 , ZAR1) 是卵母细胞特异的母性效应基因,在胚胎早期发育的母型合子转变中起重要作用。利用 RT-PCR ,亚硫酸盐测序 PCR(BSP) 、染色质免疫共沉淀 (ChIP) ,等实验技术对成年牛组织中 ZAR1 基因表达情况及该基因 5′ 调控区的 DNA 甲基化和组蛋白修饰进行研究。并采用实时定量 PCR 检测该基因在牛卵母细胞及体外受精胚胎中的 mRNA 状况。研究表明牛ZAR1 基因的表达具有组织特异性,在心脏、肾脏、睾丸中有表达,肝脏中未检测到。 DNA 甲基化和组蛋白修饰共同调控 ZAR1 的组织特异性表达。 ZAR1 在牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的表达具有动态变化,生发泡期表达量最高,随着卵母细胞的成熟表达量逐渐降低。
 (4) 利用 RNAi 技术研究 DNA 甲基化与组蛋白修饰的表观遗传调节机理
    SMYD3 在牛卵母细胞体外成熟过程中表达及功能的研究
    SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3) 是组蛋白 3 第 4 位赖氨酸二甲基化、三甲基化 (H3K4me2/3) 特异性转移酶,具有执行甲基转移酶活性的 SET 结构域和参与蛋白互作、识别特异 DNA 序列的 MYND 锌指基序。 SMYD3 通过结合靶基因启动子区序列催化形成 H3K4me3 活性转录标志,而调节其下游一系列基因的激活和表达,其中包括端粒酶逆转录酶等。研究表明,牛 SMYD3 mRNA 在牛卵母细胞减数分裂各时期持续表达,相对于 GV 期,表达水平在 MI 期、 AI-TI 期明显升高 (P < 0.05) , AI-TI 期后到 MII 期逐渐下降,但差异不显著 (P > 0.05) 。 SMYD3 在 AI-TI 期大量翻译蛋白并到 MII 期蛋白量持续上升,且始终围绕在染色体的周围。说明 SMYD3 mRNA 的积累主要在 AI-TI 期之前完成,蛋白的大量合成和发挥作用始于 AI-TI 期,可能对维持后期 H3K4me3 基因转录激活信号的形成起关键作用。
    针对牛 SMYD3 mRNA 的 siRNA 干涉序列,三片段联合对 GV 期去颗粒细胞的裸卵进行显微注射,培养 24 h 后 SMYD3 mRNA 的表达量与对照组相比下降到 18% ,干扰效率显著。 GV 期去颗粒细胞裸卵干扰 SMYD3 mRNA 表达后不影响牛卵母细胞体外成熟、受精及卵裂,但严重降低 2 细胞胚胎到囊胚的发育,而受精后 7 h 再干扰合子的 SMYD3 mRNA 表达对卵裂、 2 细胞、 8 细胞及囊胚的发育都没有影响。由此说明, SMYD3 通过激活某些在胚胎从 2 细胞到囊胚正常发育中起重要作用的基因来调节发育,并且这种影响是在卵母细胞成熟晚期而非受精后建立的。
    3 、哺乳动物早期胚胎发育机理的研究
    负责人:刘东军
    主要研究人员:仓明、马玉珍、周平、李海军、王立民
    (1) EGF 、 TGF a 、 EGFR 在绵羊早期胚胎中的表达和作用研究
    本研究主要通过免疫组织化学和 RT-PCR 的方法检测了 EGF 、 TGF a 及其受体 EGFR 在绵羊卵母细胞、早期胚胎和雌性生殖道中的表达情况;在成熟培养液和发育培养液中添加不同剂量的 EGF 、 TGF a ,观察其对卵母细胞和胚胎发育的影响;采用 RNAi 的方法进一步探讨了 TGF a 及其受体在绵羊早期胚胎发育中的作用。
    通过 RT-PCR 的方法检测了 EGF 、 TGF a 和 EGFR mRNA 在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。结果显示,在卵母细胞和早期胚胎中均未检测到 EGF mRNA 的表达。在未成熟的卵母细胞、成熟的卵母细胞和早期胚胎中均有 TGF a 和 EGFR mRNA 的表达,成熟卵母细胞中的表达量明显高于未成熟卵母细胞中的表达量。卵母细胞在成熟过程中丰富地储存了这两种生长因子的 mRNA ,随着胚胎的发育储存的 mRNA 迅速减少。 TGF a mRNA 的量在 8 细胞期下降到最低水平,并随着胚胎基因组的激活胚胎开始转录 TGF a ,使 TGF a mRNA 表达总量保持在一定水平,持续到桑椹胚期; EGFR mRNA 的量在胚胎发育到桑椹胚期下降到最低,而囊胚期胚胎中的整体表达量又上升。
    通过RT-PCR 的方法检测了 EGF 、 TGF a 和 EGFR mRNA 在生殖系统中的表达。结果表明,在卵巢细胞和排卵后的输卵管上皮、子宫上皮和胎盘小叶细胞中均没有检测到 EGF mRNA 。 EGFR mRNA 在排卵后 7-8 天的子宫上皮细胞和胎盘小叶中表达水平相对较高,而在卵巢细胞和排卵后输卵管中的转录水平较低; TGF a mRNA 在输卵管中的表达水平明显高于子宫上皮和胎盘小叶。输卵管中 TGF a 维持在较高水平可能有利于早期胚胎的发育, EGFR 在子宫和胎盘小叶中的高表达可能有利于上皮细胞的进一步增殖分化,为胚胎的着床和胎儿妊娠提供合适的环境。
    通过免疫组织化学的方法研究了 TGF a 和 EGFR 蛋白在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。 EGFR 和 TGF a 在未成熟卵母细胞、卵丘细胞和成熟卵母细胞的细胞膜区域均有表达, TGF a 在受精卵中的表达量明显增加。 EGFR 、TGF  a从 2 细胞到囊胚期的胚胎中均有表达,到了扩张囊胚期 EGFR 主要分布在滋养外胚层细胞,而在内细胞团中表达量相对较低。TGF a 主要存在于接近细胞膜的膜下区域,在囊胚中,内细胞团和滋胚层细胞中均丰富地表达。体内胚胎与体外胚胎表达情况基本一致。通过蛋白印迹的方法检测表明,在卵母细胞和早期胚胎中存在两种不同构型的 EGFR ,即野生型 (170KD) 和突变型 VIII(145KD) 。未成熟和成熟的卵母细胞中主要存在 VIII 突变型,而野生型表达相对较少,成熟后卵母细胞中的 VIII 突变型蛋白明显增加。在第二天、第四天的胚胎中野生型和突变体形式受体的表达量均明显增加。
    免疫组织化学的结果表明, TGFα 在生长卵泡的颗粒细胞和排卵后 0 、 2-3 、 4-5 、 6-7 天的输卵管管腔、 6-7 天的子宫上皮和子宫腺中均有较强的表达。然而在退化卵泡中没有表达。 EGFR 仅在卵泡的颗粒细胞和排卵后 6-7 天的子宫上皮中才有表达,但在排卵后 0-7 天的输卵管中均没有表达。在子宫腺和生长卵泡的壁层颗粒细胞中有较弱的表达。
    在化学成分明确的培养系统中添加不同剂量的 EGF 和 TGF a 对早期胚胎进行发育培养,结果表明 TGF a 明显促进了囊胚期细胞的存活,改善了早期胚胎细胞的发育命运。未成熟卵母细胞中分别注射 EGFR dsRNA 、 TGF a dsRNA 和水,结果表明 EGFRdsRNA 、 TGF a dsRNA 的注射与注水和对照组相比明显降低了 EGFR 、 TGF a 目的 mRNA 的含量,注水和对照组之间基本一致。免疫组织化学染色结果显示, dsRNA 注射组与注水组和对照组相比,分别降低了 EGFR 和 TGF a 在胚胎中的表达量。成熟过程中表达量明显升高的基因 b -actin 、间隙连接蛋白 (CX-43 、 CX-45) 基因的 mRNA 与对照组相比均没有明显的变化。注射 TGF a dsRNA 组、注射 TGF a dsRNA 后培养液中加入 10ng/ml TGF a 组、注水组和对照组的卵裂率和囊胚率分别为 48.1% 、 56.3% 、 56.4% 、 73.8% 和 12.9% 、 18.9% 、 16.1% 、 32.2% ,注射 TGF a dsRNA 与注水组卵母细胞来源的胚胎之间在卵裂率和囊胚率方面没有显著的差异 (p>0.05) ,与对照组之间均有显著差异 (P<0.05) ,加入 TGF a 后卵裂率和囊胚率均比不添加组有一定提高。 TGF a 表达量的下降没有影响胚胎的发育率,但增加了囊胚中细胞的凋亡, TGF a 的加入能改善因内源 TGF a 减少而引起的滋养外胚层细胞的凋亡。 EGFR 介导的信号途径对受精卵的卵裂、囊胚的形成和孵化均有促进作用。该成果发表于“ Animal Reproduction Science ”, 2008, 104: 370-381 。
    (2) IGF-I 、 II 及其受体 IGF-IR 、 IIR 在牛早期胚胎中的表达和作用研究
    通过 RT-PCR 的方法检测了 IGF-I 、 II 和 IGF-IR 、 IIR mRNA 在卵母细胞、早期胚胎中的表达情况。结果显示在卵母细胞和早期胚胎中均检测到 IGF-II 和 IGF-IR 、 IIR mRNA 的表达;但是始终未检测到 IGF-I mRNA 的表达。 IGF-II 和 IGF-IR 、 IIR 的表达情况基本一致:它们在卵母细胞和二细胞期胚胎中主要集中在细胞边缘如膜及膜下区域;并且存在于 COC 的颗粒细胞中,以及 8 细胞期胚胎和桑椹胚的整个卵裂球细胞质中;在囊胚的滋养层细胞中可以检测到这些蛋白,但是在内细胞团中没有检测到。在 SOF+PVA 培养液中添加不同剂量的 IGF-I 对早期胚胎进行发育培养,添加 0 、 1 、 5 和 10 ng/ml IGF-I 的 8 细胞期胚胎发育率和囊胚发育率分别为 55.1% 、 55.1% 、 62.9% 、 60.9% 和 18.9% 、 19.6% 、 24.2% 、 22.7% 。在 SOF+PVA 培养液中添加不同剂量的 IGF-II 对早期胚胎进行发育培养,添加 0 、 50 、 100 和 150 ng/ml IGF-II 的 8 细胞期胚胎发育率和囊胚发育率分别为 63.6% 、 68.9% 、 61.3% 、 63.9% 和 19.2% 、 21.7% 、 30% 、 25.9% , 结果表明 8 细胞期胚胎发育率在各组之间无显著差异; 100 ng/ml 组囊胚发育率明显高于对照组,有显著性差异 (P<0.05) 。
    利用软件设计 siRNA 干涉序列,并对合成回来的序列进行干涉效果检测。对未成熟卵母细胞注射 IGF-IR siRNA 和对照 siRNA ,然后在加有成熟抑制剂的 M199 培养液中培养,分别于培养 6 小时和 24 小时后对 IGF-IR mRNA 进行定量 PCR 检测。结果显示注射 6 小时和 24 小时后 IGF-IR mRNA 表达量分别降为 72% 和 54% 。对受精卵注射 IGF-IR siRNA ,于培养 24 小时后检测卵裂胚的 mRNA 和蛋白表达,发现均有所减少。结果表明,本实验所设计的 IGF-I siRNA 具有良好的干涉效果,可以用于 IGF-I 基因敲减的研究。注射 IGF-IR siRNA 的受精卵经发育培养,于受精后第八天统计发育率和囊胚细胞数;未注射组、注射对照 siRNA 组、注射 IGF-IR siRNA 组的 8 细胞期胚胎发育率、囊胚发育率分别为 48.8% 、 46.7% 、 38.9% 和 35.4% 、 33.0% 、 23.3% ;各组囊胚细胞数分别为: 116 、 81 、 64 。结果表明,各组在 8 细胞期胚胎发育率方面没有显著差异,但是在囊胚发育率方面注射 IGF-IR siRNA 组明显低于两对照组,有显著差异 (P<0.05) ;在囊胚细胞数方面,注射后的囊胚细胞数明显低于未注射组 (P<0.05) ,注射对照 siRNA 组囊胚细胞数明显比注射 IGF-I siRNA 组囊胚细胞数多,具有显著差异 (P<0.05) 。
    研究结果表明,在牛卵母细胞和早期胚胎中有 IGF-II 和 IGF-IR 、 IIR mRNA 和蛋白的存在,但是无法检测到 IGF-I mRNA 。在成熟液和发育液中添加 IGF-II 可以提高胚胎发育率,而且在成熟液中添加 IGF-II 可以增加囊胚细胞数,但是对于凋亡细胞数没有影响。通过注射 IGF-IR siRNA 发现, IGF-IR siRNA 显著降低了胚胎发育率和囊胚细胞数。该成果发表于“ Animal Reproduction Science ”, 2009, 114: 99-108 。
(3) 牛卵丘 - 卵母细胞复合体凋亡发生和调控与其发育潜能关系研究
    本研究通过建立不同发育潜力卵母细胞的形态标准,采用多种凋亡检测手段,检测牛卵丘 - 卵母细胞复合体中卵丘细胞与卵母细胞凋亡情况及其与卵母细胞发育潜能的相关性;同时在体外成熟系统中添加外源 FasL 以诱发卵母细胞凋亡,探讨 Fas 信号通路对卵母细胞凋亡的调控作用,进一步深入了解牛卵母细胞凋亡与其发育潜能之间的相关性。
    根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞状态,将卵丘细胞完整包被的 COCs 分为:I组 ( 具有 5 层以上卵丘细胞且卵胞质颗粒化 ) ; II 组 ( 具有 5 层以上卵丘细胞且卵胞质均匀 ) ; III 组 ( 具有 2-5 层卵丘细胞且卵胞质颗粒化 ) ; IV 组 ( 具有 2-5 层卵丘细胞且卵胞质均匀 ) 。在此基础上,利用地衣红染色与体外受精技术,检查四类 COCs 中卵母细胞在体外成熟 22 小时后的核成熟情况与受精后的发育能力差异,以建立不同发育能力未成熟 COCs 形态标准。结果显示,四组卵母细胞核成熟率为: 71.8% 、 57.8% 、 84.2% 、 69.2% ;卵裂率、囊胚发育率和孵化囊胚率分别为 66.4% 、 22.7% 和 5.9% ; 57.5% 、 15.7% 和 3.9% ; 85.0% 、 38.9% 和 15.9% ; 75.0% 、 26.4% 和 8.6% 。结果表明, I 组和 III 组卵母细胞核成熟率、卵裂率、囊胚发育率和孵化囊胚率均分别高于 II 组和 IV 组。其中, III 组卵母细胞的上述各项指标明显高于 II 组 (P ﹤ 0.05) 。由于颗粒化卵胞质与轻度扩散卵丘细胞等形态特征被认为是早期闭锁发生的一种信号,所以本研究所建立的不同形态标准 COCs 的发育能力差异可能与其卵泡所处不同早期闭锁状态相关。
    Annexin-V 染色结果显示,各组卵丘细胞中早期凋亡细胞占大多数 (65.85%-83.20%) 。 III 组卵丘细胞中早期凋亡细胞比率显著高于其他三组 (P<0.05) 。 I 组早期凋亡细胞比率也明显高于 II 组 (P<0.05) 。 TUNEL 检测结果显示,各组卵丘细胞中晚期凋亡细胞比率较低 (0.78%-6.35%) 。其中, III 组卵丘细胞中晚期凋亡细胞比率显著高于其他三组 (P<0.05) 。 I 组中晚期凋亡细胞比率也略高于 II 组 (P>0.05) 。结果表明,卵母细胞发育能力较高的 I 组与 III 组中卵丘细胞也表现较高的凋亡水平,进一步验证 I 组与 III 组 COCs 可能采自具有较强早期闭锁信号的卵泡。
    免疫荧光染色结果显示, Fas 蛋白在未成熟卵母细胞中有表达,而未检测到 FasL 蛋白。 Fas 蛋白主要定位于卵母细胞膜上、核附近以及胞浆中个别区域。成熟培养液中添加不同浓度的 FasL ,观察其对成熟后卵母细胞早期和晚期凋亡的影响。 FasL 促进了成熟后卵母细胞凋亡的发生,且凋亡诱导因子的浓度与凋亡细胞率呈正相关。 FasL 诱导的卵母细胞重度凋亡明显造成卵母细胞成熟与受精后胚胎发育能力的降低,但是轻度凋亡的 2ng 组卵母细胞的成熟与发育能力似乎并没有受到影响。该成果发表于“ Animal Reproduction Science ”, 2009, 114: 89-98 。
    4 、哺乳动物精子发生及精原干细胞研究
    负责人:吴应积
    主要研究人员:罗奋华、张学明、苏慧敏、刘陶迪、候越、白音
    (1) 精子发生过程的研究
    山羊和绵羊精子发生过程的研究
    哺乳动物精子发生过程的机理大体相同但也有一定的种族特异性。当前这方面研究的瓶颈是睾丸中不同类型的生殖细胞的标记基因资料短缺,也没有相关的抗体可用于细胞的检测鉴定。为了打开研究局面,我们对山羊和绵羊不同的睾丸生殖细胞相关的基因进行克隆, cDNA 序列测定,以及抗体制备工作,为进一步研究羊精原干细胞增殖和分化打基础。已克隆的新的山羊基因为联会复合体蛋白 3(synaptonemal complex protein 3, Scp3) 的基因,已克隆的新的绵羊基因为 cdh1 , scp3 , tnp1 和 tnp2 。已经构建了抗原表位表达质粒载体并制备了抗原和抗体的有山羊的 c-kit 、 scp3 、 gapdh ,绵羊的 cdh1 。具体情况如下:
    1) 绒山羊 scp3 的基因克隆、多克隆抗体的制备及精子发生过程的研究
    联会复合体蛋白 3(synaptonemal complex protein 3, Scp3) 是雄性生殖细胞减数分裂中联会复合体形成必需的组成部分。在哺乳动物生殖细胞减数分裂中 Scp3 具有重要功能。至今为止,山羊的 Scp3 基因的序列还没有报道。本研究通过 RT-PCR 扩增和分子克隆的方法首次克隆到了绒山羊 Scp3 基因的编码区片段。测序结果表明绒山羊与牛的 Scp3 基因编码序列同源率达到 98% 。在得到 Scp3 编码区序列的基础上,通过对其抗原表位的分析,设计引物,通过 PCR 的方法得到其抗原表位高的片段,将 PCR 扩增产物克隆到 pET 44a (+) 上,进行原核表达,得到总蛋白,总蛋白经过亲和层析,得到带有组氨酸标签的目的蛋白,通过 Western blot 检测,证实得到的目的蛋白即为带有 6 个组氨酸残基的抗原表位多肽 Scp3 抗原。 Scp3 基因 cDNA 编码区核苷酸序列已经申报国家专利。 2) 绵羊 cdh1 , scp3 , tnp1 和 tnp2 的基因克隆、多克隆抗体的制备及精子发生过程的研究
    为进一步分析绵羊睾丸体内体外的精子发生过程,我们克隆了绵羊睾丸精原干细胞标记基因 cdh1 、发生减数分裂的精母细胞的标记基因 scp3 及在圆形精子细胞中开始转录的基因 tnp2 和 tnp1 。 cdh1 基因 ( 先前被认为是 E- 钙粘蛋白 ) 在小鼠睾丸 A 型未分化精原细胞中特异表达的,是一种跨膜细胞间黏着分子,可以用于在曲细精管内鉴别未分化 A 型精原细胞的形态和分布。为了对绵羊睾丸雄性生殖细胞体外共培养体系进行分子水平的鉴定,我们根据已知物种的 cdh1 基因 cDNA 编码序列,通过同源性比对,得出 cdh1 cDNA 序列的保守区,以此为基础,设计引物,通过 RT-PCR ,得到 2652bp 的 cDNA 全序列。还克隆了在雄性生殖细胞减数分裂后期表达的 tnp1 和 tnp2 基因。
    (2) 精原干细胞的研究
    精原干细胞表达红荧光蛋白小鼠模型的建立
    我们设计制作在精原干细胞中表达红荧光蛋白而在睾丸其他细胞不表达红荧光蛋白的大鼠、小鼠模型,原理是未分化的精原干细胞表达红荧光蛋白而已分化的精原干细胞失去红荧光蛋白,使精原干细胞的自我更生增殖及分化便于观察。已经完成了红荧光蛋白表达载体的构建及 PCR 和 DNA 序列的鉴定工作,开展了在相关细胞中特异表达红荧光蛋白的试验,检测了该载体在细胞中的表达红荧光蛋白的活性。在此基础上,委托中国医学科学院实验动物研究所人类疾病模型研究中心用于转基因鼠的制作,已获得 5 只转基因鼠始建者,正在进行分析鉴定。
    (3) 乳腺生物反应器表达载体的研究
    已成功地构建了山羊乳腺中特异表达人神经营养因子 -3(hNT-3) 的随机整合质粒载体。对所构建载体进行 PCR 和限制性内切酶片段分析鉴定,进而进行 DNA 序列鉴定。按照设定的技术路线进行分子克隆操作和鉴定,已获得了在山羊乳腺中特异表达人神经营养因子 -3(hNT-3) 的质粒载体。用 RT-PCR 方法检测证明用表达载体转染的乳腺癌细胞中有 hNT-3 mRNA 转录表达。转染的乳腺癌细胞经过诱导培养 48 小时后,用蛋白质印迹法检测到细胞培养液中存在 hNT-3 蛋白质,证明 hNT-3 已从细胞中分泌出来,从中显示我们所构建的 hNT-3 羊乳腺生物反应器表达载体具有生物活性。
    完成了人 gdnf 在牛 β-casein 基因座定位整合载体 pNRTCNbG 的构建。该打靶载体选用 pPGK-neoLoxP 作为骨架载体构建人 gdnf 基因打靶牛 β-casein 基因座的正负筛选打靶载体 pNRTCNbG 。用脂质体介导法将其导入人乳腺肿瘤上皮细胞系 Bcap-37 细胞中,检测打靶载体 pNRTCNbG 的生物学功能。经 G418 抗性筛选 8-10 天后,获得了表达红色荧光蛋白的稳定转染 pNRTCNbG 的人乳腺上皮细胞单克隆。将单克隆细胞扩大培养后,经 PCR 检测结果表明,牛 β-casein 基因启动子驱动的人 gdnf 基因已整合到表达红色荧光蛋白的人乳腺上皮细胞中。用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经 RT-PCR 和 Western Blot 检测表明,牛 β-casein 基因启动子驱动的人 gdnf 基因能够在人乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。随后,将质粒载体转染牛胎儿成纤维细胞,以筛选中靶牛胎儿成纤维细胞为核供体,去核卵母细胞为胞质受体制作转基因克隆胚胎,制备基因打靶克隆囊胚。 PCR 检测表明克隆囊胚全部为转基因阳性。该成果发表于“ Applied Biochemistry and Biotechnology ”, 2009 。
(4) 精原干细胞移植法研究
    我们在国内率先开展绵羊精原干细胞睾丸移植实验,从 2006-2007 年间,已进行了一些活体羊睾丸移植的试验,但是没有取得成功。最近这次试验是从 2008 年开始的。 1 月中旬制作受体公羊,受体公羊品种为无角多赛特,受体羊采用 γ 射线局部照射绵羊睾丸,经过两个半月后,用于睾丸精原干细胞移植。 4 月下旬进行供体公羊 ( 蒙古绵羊 ) 睾丸单细胞悬液的制备和精原干细胞的富集,并注射到受体公羊的睾丸中。于去年 4-7 月进行活体绵羊精原干细胞睾丸移植。今年 2 月到 4 月,活体绵羊精原干细胞移植实验已产下 6 只羊羔。其中 4 只生长健康正常, 1 只在出生时死亡, 1 只在出生后几天死亡。从体型、毛、耳朵、尾巴等外表遗传特征判断,产下的 6 只羔羊中,有 5 只为供体公羊的后代, 1 只为受体公羊的后代。这些后代的遗传鉴定正在加紧进行。
5、哺乳动物卵母细胞减数分裂、家畜克隆研究
    负责人:李光鹏
    主要研究人员:白春玲、魏著英、刘慧、雪莲、其布日、程磊、焦泽华、银凤霞、吴侠
    I 、哺乳动物卵母细胞减数分裂机理研究
    (1) 小鼠卵母细胞成熟及胚胎发育过程中转录因子的分布与功能
    本研究通过研究减数分裂及发育过程中关键转录因子与染色体及微管、微丝等的相互关系和作用,来探讨其在卵母细胞成熟及胚胎发育过程中的作用。 TFIIB 与 α-tubulin 分布的吻合性并未随 Colcemid 对微管蛋白组装的破坏而发生显著改变,说明 TFIIB 在减数分裂过程中可能通过与 α-tubulin 及其相关蛋白结合维持其与染色体之间的联系,以保证其在重编程过程中发挥起始转录的功能; TFIIB 与 α-tubulin 分布的吻合性并未随 CB 对细胞骨架蛋白的破坏 ( 主要破坏影响微丝的装配及分布 ) 而发生显著改变,但其影响要比 Colcemid 处理组明显一些,同时在 CCB 处理的某些样品中可以观察到 TFIIB 信号极弱,由此可推测 TFIIB 与微丝之间可能也存在某些联系。
    分别向 GV 期及 MII 期卵母细胞胞质内注射 TFIIb siRNA 。对 GV 期卵母细胞中 tf2b mRNA 进行干扰,并不影响卵母细胞成熟,但可使卵母细胞发育停滞于 2 、 4 及桑椹胚之前的各个阶段而只有极少数可发育至囊胚 (3.7%) ;对 MII 期卵母细胞进行干扰则没有得到与 GV 期一致的结果,囊胚为 36.2% 。 通过激光共聚焦观察,初步明确了九种转录因子在小鼠卵母细胞成熟过程中的动态分布规律: ① 分布在胞质中的转录因子包括: baf 、 brg 、 TFIID 、 topob ; ② 结合在纺锤体上的转录因子包括: hdac 、 hp 、 taf 、 tf2b 、 topoa 。
    (2) 绵羊、山羊、牛卵母细胞减数分裂机理研究
    绵羊、山羊、牛的 GV 期、前中期 I(Pre-MI)) 、中期 I(MI) 、后期 I/ 末期 I(AI/TI) 、第二次减数分裂中期 (MII) 的卵母细胞在染色体 ( 质 ) 形态与细胞骨架分布上存在一些形态学上的区别。促微丝聚合剂 Jasplakinolide(JAS) 对牛卵母细胞减数分裂具有浓度依赖性作用。 JAS 引起纺锤体微管的形态改变,出现了两个纺锤体、巨大纺锤体和多极纺锤体等异常结构;影响染色体的排列和分离,多倍体现象严重;经 JAS 处理的卵母细胞,其孤雌发育受到了影响; JAS 处理后的卵母细胞的克隆胚发育率受到了影响。
    II 、哺乳动物克隆机理及转基因研究
    优质肉牛体细胞克隆 选择了世界顶级的日本和牛为材料,从牛的耳朵上剪取了大约 0.5 厘米 大小的一块组织,并培养得到成纤维细胞。对体细胞克隆技术的每一个环节都进行了适当改进。试验结果表明,细胞的融合率为 85% 以上,囊胚发育率平均为 45% 左右,最高可达 75% 。将培养 7 天的囊胚移植入同期发情的 18 头受体母牛 (1.9 枚 / 头 ) , 2 个月妊检时的妊娠率为 50%(9/18) ,到 7 个月龄时,妊娠率仍为 44%(8/18) 。有 6 头受体牛妊娠到期,发育到期率为 33% 。产下 5 头健康犊牛,出生时体重分别为: 21.2 、 59.5 、 32 、 45 和 55 公斤 。妊娠期为 273 天至 310 天。这 5 头犊牛均健康存活。
    优秀肉羊克隆 以优秀肉羊美利奴羊作为实验对象,从羊的耳部采得一小块组织培养成细胞系,通过克隆手段生产出克隆胚胎。把 224 枚克隆胚胎移植到 37 只受体母羊中, 60 天后有 6 只受体羊妊娠。其中有 4 只发育到期,存活 1 只。受孕率、发育到期率、产仔率分别为 16.2% 、 10.8% 、 10.8% 。存活的克隆美利奴肉羊出生体重为 5.75 公斤 , 60 天时的体重为 36 公斤 ,到 100 天时体重达到 50 公斤 ,平均日增重 0.5 公斤 ,显示出优秀肉羊的发育生长优势。

高产绒量绒山羊的克隆 选取一只高产绒量的公绒山羊,取其耳部组织培养得到成纤维细胞,以屠宰山羊卵巢卵母细胞为受体胞质构建克隆胚胎。把 129 枚克隆胚胎移植到 14 只本地山羊输卵管内。结果妊娠 3 只,其中的 2 只流产,另一只于 2009 年 4 月 30 日 出生,健康状态良好。出生体重 3.1 公斤 ,出生 10 天体重为 4.5 公斤 。到 60 天时,体重达到 21 公斤 。此次试验的妊娠率为 21.4% ,产仔率为 7.1% 。
    转基因克隆羊 针对国家转基因重大专项,首先要从方法学上建立起有效的操作体系。我们将绿色荧光蛋白基因或红色荧光蛋白基因转染到美利奴胎儿成纤维细胞;或将绿色与红色荧光蛋白基因同时转染到绵羊胎儿成纤维细胞中,得到转有双基因的转基因细胞系。通过克隆技术生产出转基因克隆胚胎,然后把 221 枚克隆胚胎移植到 27 只小尾寒羊体内。有 4 只妊娠,其中 1 只流产,有 3 只发育到期,其中 1 只健康存活下来。妊娠率、发育到期率、出生率分别为 14.8% 、 11.1% 、和 11.1% 。出生时的体重分别为 5.2 公斤 、 5.8 公斤 和 4.9 公斤 。存活的克隆羊生于 2009 年 5 月 9 日 ,出生体重为 5.8 公斤 ,满月时体重为 22.5 公斤 。
    转基因克隆牛 本研究所转的基因是分离自线虫的多不饱和脂肪酸转移酶基因 ( 即 fat-1 或 ω-3 基因 ) 。与中国科学院、吉林大学等单位联合,分离并构建成 fat-1 候选基因,筛选出转染有 fat-1 基因的牛成纤维细胞。利用克隆技术生产克隆胚胎。融合率为 81% 、卵裂率为 84% 、囊胚率为 34% 。把 34 枚囊胚移植到 18 头受体母牛中。 2 个月妊检时的妊娠率为 16%(3/18) ,这 3 头妊娠牛移植妊娠到期,有 2 头于 2009 年 6 月 23 日 顺产出犊牛。在本稿定稿时,第三头仍处妊娠中。经初步鉴定,生产的 2 头犊牛均为转基因牛。据我们所知,这是世界上首例转 fat-1 基因的克隆牛。
    III 、胚胎干细胞、成体干细胞、诱导干细胞研究
    (1) 小鼠卵巢移植及移植后胚胎干细胞的分离和细胞系的建立
    卵巢移植被认为是将来建立卵母细胞库的一项新技术。将性成熟昆明小白鼠卵巢移植到肾包膜下,移植后 19 天,将卵巢取出,收集 GV 期和 AI-TI 期卵母细胞,体外培养排出极体后受精,培养至囊胚期,将一部分胚胎移植到假孕受体子宫内,一部分用于分离胚胎干细胞。结果显示,移植卵巢得到的卵母细胞体外成熟后卵母细胞直径小于正常体外成熟及体内成熟得卵母细胞;移植得到的卵母细胞核型正常;体外受精后的能够支持胚胎发育至囊胚,移植到假孕受体的子宫中,得到健康的仔鼠;从囊胚中分离的胚胎干细胞体外培养能够形成克隆,核型为正常的二倍体,荧光免疫染色 OCT4 、 SSEA1 、 APK 呈阳性,在无饲养层和无 LIF 的培养液中能够形成类胚体,将此干细胞注射到免疫缺陷小鼠皮下 2-3 周后,能够形成来源于三个胚层细胞的畸胎瘤。因此,通过卵巢异位移植获得的卵母细胞具有正常的卵母细胞功能。
    (2) 大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养及诱导分化的研究
    采用两步酶消化法和差速贴壁法分离纯化大鼠肌肉卫星细胞。通过结蛋白免疫细胞化学染色和分析肌肉卫星细胞特异表达基因 MYF5 、MYOD1 鉴定骨骼肌卫星细胞。通过成脂和成骨诱导证明其具有多向的分化潜能。并将成骨诱导获得的细胞进行骨特异基因骨钙素 (OCN) 和 I 型胶原 (COL-I) 的检测,将成脂诱导的细胞进行脂肪细胞标志基因 PPARγ 和 C/EBPα 的表达检测。通过实时定量 PCR 或者流式细胞仪检测 MYF5 、 MYOD1 、 MYOG 和 PAX7 在骨骼肌卫星细胞分离过程中不同时期的表达情况,进一步确定激活的卫星细胞、静息态的卫星细胞和成肌细胞在不同时期的比率。

 (3)小鼠诱导多潜能干细胞的研究 (Mouse Induced Pluripotent Stem Cell, miPS cell)
    本研究首先以 pMXs 逆转录病毒载体作为骨架,构建了 pMXs-DSred 表达红色荧光载体,用该载体转染 plat-E 包装细胞,并对其转染效率进行了优化。结果显示,当使用 Lipofectamine2000 作为转染试剂, DNA 与 Lipo2000 比为 3ug:6uL 且转染过程中添加 5% 的血清,转染 15h 的转染效果最好,且细胞毒性小,通过流式细胞仪检测转染细胞率可达 19.81% 。在此研究基础上,将 pMXs-oct4 、 pMXs-sox2 、 pMXs-myc 、 pMXs-klf4 、 pMXs-Dsred 分别转染 plat-E ,并生产病毒,用该 5 种病毒的混和液对小鼠成纤维细胞进行了感染,并用流式细胞仪检测了感染后细胞红色荧光的表达。结果显示,有 50% 以上的细胞表达红色荧光。将细胞转入干细胞培养液中诱导 2 周,观察有干细胞样的克隆长出,共分离得到 2 个细胞克隆,将其进行消化传代,一个克隆的细胞不能够继续维持干细胞样的形态,另一个克隆经 2 周培养还表现出干细胞的形态特性,细胞生长很旺盛,细胞较小,能够形成突起的克隆,克隆边缘光滑,折光性好,但是在细胞生长的过程中还有细胞在不断的分化。培养条件的进一步的优化和分子生物学鉴定正在进行中。
    6 、动物克隆与种质资源保存研究
    负责人:李荣凤
    主要研究人员:乌云毕力格、梁浩
    (1) 哺乳动物雌性和雄性基因组复制的研究
    利用小鼠进行预备试验,应用不同浓度的乙醇 (5% 、 7% 、 10% 、 15%) 、 SrCl 2 和 SrCl 2 +CB 对注射 hCG 后 15-16h 的小鼠卵母细胞进行孤雌激活,以获取单倍体胚胎。结果显示, 7% 乙醇激活后的卵裂率 (81.91%) 显著高于其他浓度 5%(59.18%) 、 10%(64.44%) 、 15%(61.22%) 而与 SrCl 2 (84.44%) 、 SrCl 2 +CB(84.78%) 没有明显区别。用 7%( 单倍体胚胎比率: 81.25%) 、 10%(77.78%) 和 15%(80.00%) 乙醇激活产生的单倍体胚胎的比率高于 5% 乙醇 (75.00%) ,且四个乙醇处理组都高于单独 SrCl2 激活处理组 (62.50%) 。由此可见, 7% 乙醇 ( 激活处理 6min) 是比较理想的获得单倍体胚胎的激活方法。
    根据上述预备试验研究结果,结合猪卵母细胞孤雌激活研究的特点,采用电激活、电激活 +CB 以及 5% 、 7% 、 9% 和 11% 乙醇 5min 激活处理猪卵母细胞,结果显示电激活处理可获得 25% 的囊胚发育率,其中 33% 的胚胎为单倍体,乙醇处理组未观察到囊胚发育,下一步准备探讨不同的激活时间,以期获得囊胚发育和较高的单倍体比率。
    (2)猪胚胎冷冻保存的研究
    猪胚胎由于含有二倍于羊三倍于牛的脂肪颗粒 ( 猪牛羊卵母细胞内的脂含量分别为 156 、 58 和 89ng) ,对温度高度敏感,甚至不能耐受 10 ℃ 范围内的温度变化,其冷冻保存技术的发展远远滞后于牛羊。我们于 2006 年利用显微操作去脂法培育出了世界首批 ( 八头 ) 经胚胎冷冻保存的体细胞克隆转基因猪,该成果发表于 ?Biology of Reproduction? 杂志上,多家媒体第一时间报道了该项研究成果。显微去脂虽然解决了克隆胚胎冷冻保存的问题,但由于需要精确和耗时的显微操作,同时破坏了普遍认为可作为病毒屏障的透明带的完整性而不适合于体外受精胚胎的冷冻保存和运输。针对这一问题,我们于 2007 年又成功发展了一种无需显微操作的早期胚胎去脂方法, 利用该方法已经获得了 80% 的冷冻解冻存活率、 43% 的移植受胎率和 20% 产仔率 ( 移植 174 枚胚胎给七头受体,平均每头受体 25 枚胚胎,其中 3 头怀孕,产出 15 头健康仔猪 ) 。同时我们也将该方法应用于克隆胚胎的冷冻,获得了健康克隆仔猪,大大简化了冷冻克隆胚胎的生产程序。目前该项技术的国际专利申请 (US61/190515) 已进入实审阶段,专利题目为: High- throughput method to vitrify porcine embryos 。该技术的成功不仅解决了猪胚胎冷冻保存这一世界性难题,同时也为其它脂含量高的哺乳动物胚胎甚至珍稀濒危动物胚胎的冷冻保存提供了线索和思路。该项研究成果不但具有重要的学术价值,同时在医学和畜牧业方面将具有广阔的应用前景。 (3) 肉牛肌生成抑制素 (MSTN) 基因敲除的研究
    已经构建了两套基因敲除通用骨架载体,分别为 CMV 增强子 -PGK 启动子 - 新霉素抗性基因 (neo r )- 内部核糖体进入位点 (IRES)- 红色荧光蛋白基因和 Loxp-PGK-neo-polyA-Loxp 两个载体骨架。同时,牛 MSTN 打靶载体同源臂的克隆和测序已经完成,近期内即可完成同源臂和骨架载体的连接,并实施胎儿成纤维细胞打靶。
    (4) 人 - 牛异种核移植